PCR 產物純化方法（酚/氯仿）:
1. 取 PCR 產物（此次為 200 ul），加入 50 ul 酚，加入 50 ul 氯仿/異戊醇（分相上層應該是澄清的，如果不是澄
清，可以再次離心 5 min，將澄清上清取出）；
2. 劇烈振蕩（100 bp 的小片斷沒有必要劇烈振蕩），混勻后，離心 6000－8000 轉（一般大片斷離心 10000 rpm），
5 min。（只能離心 5 min，過久的話就會酚變成沉淀）；
3. 取上請，不要吸到中間箱，吸取后再在棄液中加入雙蒸水，再次離心，收集上清，反復兩次；
4. 上請 2 倍體積的 100％乙醇以及 0.2 倍體積的 NaAc 沉淀，-20oC（1 h 也可以）過夜沉淀（異丙醇效果更好，
但是不純）；
5. 12000 轉，離心 20min，棄去上請。70％乙醇清洗一次，離心，12000 rpm，10 min，重復洗滌 1－2 次（多
洗幾次除去酚雜質）；
6. 棄去乙醇，充分晾干，雙蒸水融解。
2.13. 大腸桿菌菌落 PCR
1．取適量 PCR 薄壁管，置于冰上，每管先加入 17.3ul 的滅菌水。
2．用滅過菌的 10ul 小槍頭挑取單克隆白斑至滅菌水中，振蕩混勻。
3．依次加入：
10xBuffer 2.5
MgCl2（25mM） 1.8
DNTP（2.5mM） 1
T3 引物（10pmol） 1
T7 引物（10pmol） 1 33
Taq 酶 0.4
Total 25ul
各試劑均加好后，離心機上甩一下，使之沉底，置于 PCR 儀上
4． 94℃ 2 min
94℃ 4 min
94℃ 40 s
53.6℃ 40 s，35 個循環
72℃ 4 min
72℃ 10 min
4℃ 24 h
5．待 PCR 反應進入 4℃后，取下 PCR 薄壁管，取 7ulPCR 產物加入 3ul 溴芬蘭跑電泳，同時上 1Kb DNA ladder。
半小時后照相，觀察膠圖，根據膠圖粗略鑒定插入片段的大小及小片段率。
6．將快速鑒定和菌落 PCR 檢測合格的文庫送檢。不必要額外煮沸。只需要挑取少許克隆，在配好的 PCR 反應
液中涮幾下，然后用正常的 PCR 反應程序即可。因為在 PCR 第一個循環 94°變性的步驟中（正常設置為 4-5min 即
可），質粒或基因組肯定有釋放，也足夠 PCR 反應的模板用量了，這個我每天都在做，還沒有做不出的時候。
只需要挑取少許克隆，在配好的 PCR 反應液中涮幾下，然后用正常的 PCR 反應程序即可。因為在 PCR 第一個
循環 94°C 變性的步驟中（正常設置為 4-5min 即可），質粒或基因組肯定有釋放，也足夠 PCR 反應的模板用量了，
這個我每天都在做，還沒有做不出的時候。
補充幾點如下：
1. 沾有菌落的牙簽在 PCR 反應液中涮過之后，還可以直接扔到 LB 培養基中用來接種（問題不大，重組質粒一般都
含抗性的）。
2. 在做菌落 PCR 的時候，每次都要做陰性、陽性對照，陽性對照可以用抽提好的質粒或基因組，這樣可以確定 PCR
主反應液的配制沒有問題，不會因為菌落 PCR 陰性而懷疑 PCR 的反應；陰性對照加一點水或者什么都不加，這樣可
以幫助識別 PCR 反應是否有假陽性產生的可能；如果偷懶的話，陰性對照可以不做，但陽性對照則是必須要做的。
3. 再告訴大家一個偷懶的菌落 PCR 鑒定的方法：按照每次反應 15-20 ul 的體系計算好 PCR 各反應組分的量/次，
然后一次性配制 100 次或 50 次反應的量，做成 Ready-to-use 的 PCR 主反應液（除 Primers、Taq 酶不加，模板
用的是菌落），每次做菌落 PCR 的時候，只需要根據反應的個數，吸取相應的 PCR 主反應液，補加相應的 Primers、
Taq 酶，再分裝即可。這樣的好處有二：即開即用，節省時間；另外反應組分均一，可減少實驗批次之間的誤差。
用槍頭挑取半個菌落，加入 MIX(除了模板其他的都有），平板放入培養箱繼續培養。等 PCR 結果出來了，直接
挑取陽性克隆搖菌。
還可以采用菌落裂解電泳的方法直接挑取重組子。一般目的片段如果不是很小，空載體和重組載體比較容易區分的
話，都可以采用這種方法。 將菌落培養時間稍微延長，挑取半個菌落加入裂解液中，同時挑取藍斑（如非蘭白斑，
直接取空載體質粒）作為對照，電泳即可區分。 這個方法有現成的試劑盒，也可以自己配制。
菌落 PCR：我的做法是用槍頭挑菌落，在分裝好的 pcr 反應體系（除了 Taq 酶）中吸幾下，然后在 100 度 5 分鐘裂
解后加入 Taq 酶，然后就可以進行 pcr 循環了。
更新時間：2025-09-12
點擊次數：563
當前位置：
上一個：
返回列表
